徠卡倒置熒光顯微鏡

徠卡倒置熒光顯微鏡由于高分辨掃描電鏡的間世，為用表面標記技術觀察細胞表面形態(tài)和區(qū)別兩類紉胞群與其表面形態(tài)相的機能提供了條件。用此技術方法可研究細胞表面抗原、受體的性質，分布及運動。在原則上，透射電鎊與熒光顯微鏡用的免疫標記技術也適用于免疫掃描電子顯微術。但由于徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡與透射電鏡的成像原理不同，因此對免疫掃描電境術的標記物有些特殊要求。這些要求是：

1．清晰、容易識別的形狀‘對透射電鏡的標記物要求電子致密度高，掃描電鏡的標記物電子密度不是重要問題，而形狀是識別的重要因素。

2．大小適宜：一般而言掃描電鏡分辨率低于透射電鏡，此外掃描電鏡標本要金屑鍍膜，這都影響樣品表面結構的分辨。因此標記物若太小、結構過于微細，就不能與樣品表面固有結構區(qū)別，但標記物過于大，又不能明確定出去面抗原位置，因此標記物大小要兼顧以上兩方面。

3.化學性質穩(wěn)定，在標本處理過程中不會被損壞品制備過程中能牢固地結合。

4.對細胞表面的固有親合力差。

符合以上條件的較常用的表面標記切有人工合成的非生物材料（膠乳顆粒，硅酸聚合物等），生物大分子（鐵蛋白，血藍蛋白等），病毒（1MV），噬茵體和肢體金顆粒等。

徠卡倒置熒光顯微鏡膠乳顆粒有聚苯乙烯和丙烯兩種*聚苯乙烯類顆粒表面疏水，易發(fā)生自聚集。但與抗體以適當比例混合時，不需偶聯(lián)便能很好地與抗體附著。丙烯類顆粒表面有oH基，自發(fā)聚集少。標記時可利用oH基進行偶聯(lián)。

如果樣品以苯乙烯樹脂做為包埋劑，徠卡倒置熒光顯微鏡再行割斷法做掃描電鏡觀察是十分方便的。因為苯乙烯聚合后，氧化丙烯及醋酸異戊酌等很容易將其溶解，多次更換溶劑便可將苯乙烯清除干凈。因此，在制做透射電鏡標本時，多做出幾個包埋膠囊樣品，待聚合后，按上述方法割斷，將割斷好的樣品放在氧化丙烯中，約2小時后便可經(jīng)酷酸異戊酷置換、臨界點干燥。

除樹脂割斷法外，徠卡倒置熒光顯微鏡尚有有機溶劑（酒糟、酷酸異戊圈等）割斷法；水溶性包埋劑（二甲基亞礬、甘油等）割斷法及其它（冷凍、氟里昂等）割斷法，操作都很容易。再以酒精割斷法為例：樣品固定后用酒精脫水，當脫水完成后，將樣品投入預先裝有無水乙醇的膠囊中（避免出現(xiàn)氣泡）。將膠囊放在低溫裝置內使乙醇固化。進行樣品割斷。割斷的樣品立即進入置于室溫的無水乙醇中，待乙醇融化后移入醋酸異戊酷、進行臨界點干保。

徠卡倒置熒光顯微鏡硅酸聚合物顆粒為球形。使用時先加入Y一氨基三乙氧基丙硅烷（Y咆加n04r出hoxypr叩山1ane）使顆贛表面帶一NH3，然后再與抗體偶聯(lián)。

TMv長300nmp寬16nm助長桿狀結構。掃描電鏡下識別性好。能與18G牢固地結合，形成TMv一[8G復合物。如果紅細胞表面附有正常免[8G，TMv便能使這種紅細腦布滿桿狀物*由于該病毒過長使分辨率下降，也有實驗室將其截短使用。

常用的噬茵體是T4噬苗體（以大腸桿菌為宿主）有頭有尾，形如瞅助。在徠卡倒置熒光顯微鏡掃描電鏡下識別性能好。但體積較大，由x174也是以大腸桿菌為宿主的噬茵體，呈二十面體。因為體積較小，需用高倍觀察。

如果徠卡倒置熒光顯微鏡應用高分辨率掃描電鏡．金標記是理想的。鐵蛋白雖然有高電子密度，但分子畢竟大小，因而應用有限。

徠卡倒置熒光顯微鏡關于抗體的純化與透射電鏡所用的有關方法相同，抗體與標記物的偶聯(lián)也不在此贅述。

備注：徠卡倒置熒光顯微鏡，部分文章由北京中儀光科科技發(fā)展有限公司，編輯整理上傳。